Primeiramente, vamos falar um pouco sobre a Salmonella?
Segundo dados da Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS), cerca de 600 milhões de pessoas (1 a cada 10 habitantes) adoecem e 420 mil morrem anualmente após a ingestão de alimentos contaminados por bactérias, vírus, parasitas ou substâncias químicas. A Salmonella é responsável por significativas taxas de morbilidade e mortalidade todos os anos ao redor do mundo.
O gênero Salmonella é dividido em duas espécies, sendo elas S. enterica e S. bongori. A espécies S. enterica é dividida em 6 subespécies, entre elas, podemos chamar atenção para a S. enterica subespécie enterica, responsável por cerca de 99% das doenças e infecções causadas por este microrganismo. Já em relação aos sorotipos de Salmonella, existem hoje mais de 2.600 já descritos, sendo os mesmos classificados de acordo com os seus antígenos somáticos (O) e flagelares (H).
Sabendo que a Salmonella possui grande colaboração quando o assunto é contaminações causadas por bactérias em alimentos, cada vez mais o Sequenciamento do Genoma Completo tem se mostrado uma importante metodologia para caracterização deste microrganismo.
A distinção da Salmonella em sorovar se provou muito útil, já que algumas características específicas se correlacionam com o sorovar, como por exemplo virulência e patogenicidade. Dois sorovares comuns que podemos citar, são a Salmonella enterica sorovar Enteritidis e a Salmonella enterica sorovar Typhimurium.
Sequenciamento do Genoma Completo da Salmonella
O Sequenciamento do Genoma Completo, do inglês Whole Genome Sequencing (WGS) se tornou a metodologia considerada padrão-ouro na identificação e caracterização de isolados bacterianos, entre eles, a Salmonella. O WGS já é utilizado por diversos órgãos de saúde em substituição a outras metodologias disponíveis.
Na Neoprospecta, utilizamos essa metodologia em um ensaio chamado Sorotipagem molecular SLM. Nele, realizamos o Sequenciamento do Genoma Completo de isolados de Salmonella enterica. Este ensaio permite tanto a identificação dos sorotipos de Salmonella como a comparação dos mesmo com genomas de referência. A avaliação da similaridade entre os genótipos a partir desta comparação entre genomas, denomina-se análise de clonalidade.
Assim como na análise de identificação e caracterização de bacteriófagos, o ensaio de Sorotipagem molecular SLM envolve a metodologia WGS seguida por análises de bioinformática.
Na primeira etapa, o Sequenciamento do Genoma Completo, o DNA isolado de Salmonella é extraído e clivado via shotgun em pequeno fragmentos, com cerca de 500 pares de base. Estes fragmentos são então ligados a adaptadores para o sequenciamento de DNA em Plataforma Illumina. Os genomas de Salmonella enterica possuem um tamanho médio de 4.8Mb, isso corresponde a cerca de 4.800.000 bases nucleotídicas. Com o WGS, identificamos e caracterizamos cada um destes nucleotídeos.
A segunda etapa são as análises de bioinformática. Com o DNA extraído, clivado e sequenciado, passamos para as análises de bioinformática. Estas análises são utilizadas para a montagem do genoma completo e comparação com bancos de dados de referência. Assim, conseguimos buscar genes específicos relacionados com a sorotipagem, genes de virulência e genes marcadores.
Esta metodologia nos garante resultados de grande importância do ponto de vista epidemiológico. Além disso, é a mais abrangente, chegando na maior resolução para avaliação e comparação dos isolados de Salmonella. Entre os diferentes métodos disponíveis, o WGS se destaca em diversos pontos. Entre eles podemos citar a maior resolução, que permite a avaliação do perfil de clonalidade entre os isolados bacterianos.
Quais as aplicações da análise de Sorotipagem molecular SLM na indústria de alimentos?
Como citado anteriormente, o WGS permite que uma análise de clonalidade seja feita. Esta análise é utilizada em indústrias de alimentos para rastrear a origem de contaminações causadas por Salmonella. Com ela, conseguimos entender a rota de dispersão do microrganismo e responder questões como: Esse microrganismo veio da granja ou já estava habitando a fábrica?
Além disso, outras vantagens desta análise envolvem por exemplo: saber o potencial de um determinado sorotipo sobreviver a um processo de higienização, entender a epidemiologia do sorotipo em questão, bem como identificar genes de virulência, de patogenicidade e de resistência.
Uma outra aplicação desta análise que podemos destacar envolve a RDC 331/2019 e a IN 60/2019. Estas duas normativas substituem, a partir de dezembro de 2020, a RDC 12/2001. Uma das principais alterações trazidas por estas normativas está relacionada justamente com a Salmonella, onde alguns produtos, e podemos destacar aqui a categoria de aves, passam a precisar analisar especificamente sorotipos de Salmonella, sendo elas S. Enteritidis e S. Typhimurium.
E para complementar as aplicações desta metodologia associado com normativas, podemos também destacar que este ensaio pode auxiliar as indústrias a garantirem produtos de acordo com a legislação específica do país para onde estão exportando seus produtos.
E por falar em RDC 331/2019 e a IN 60/2019, você já está por dentro das alterações trazidas por estas normativas?
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Referências
ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DE SAÚDE (OPAS). Segurança dos alimentos é responsabilidade de todos. 2019. Disponível em: <https://www.paho.org/bra/index.php?option=com_content&view=article&id=5960:seguranca-dos-alimentos-e-responsabilidade-de-todos&Itemid=875>. Acesso em: 01 de out. de 2020.
ROBERTSON, J. et al. Comprehensive assessment of the quality of Salmonella whole genome sequence data available in public sequence databases using the Salmonella in silico Typing Resource (SISTR). Microbial genomics, v. 4, 2018.
UELZE, L. et al. Performance and Accuracy of Four Open-Source Tools for In Silico Serotyping of Salmonella spp. Based on Whole-Genome Short-Read Sequencing Data. Applied and Environmental Microbiology, v. 86, p. 1-14, 2020.
ZHANG, X. et al. In silico Identification of Serovar-Specific Genes for Salmonella Serotyping. Frontiers in microbiology, v. 10, 2019.