A diversidade biológica de Salmonella é representada por mais de 2.600 sorovariedades (Ex. Enteritidis, Thypimurium, Typhi, Newport, Infantis, Gallinarum, Pullorum), classificadas de acordo com o esquema proposto por Kauffmann e White e utilizado há mais de 70 anos. Esta classificação envolve a identificação dos antígenos somáticos (O), flagelares (H) e capsulares (Vi) presentes nas células de Salmonella.
Com o avanço das metodologias de biologia molecular, novas formas de sorotipagem foram desenvolvidas baseadas na sequência do DNA das bactérias (ex. PFGE, Ribotipagem, MLST, Sequenciamento de genoma completo – WGS).
As principais formas para identificação de sorotipos de Salmonella
-
Ribotipagem (Ribotyping)
Método molecular baseado na fragmentação do DNA com de enzimas de restrição e posterior hibridização com sondas específicas para os genes de RNA ribossomal.
Neste método, o DNA genômico dos isolados de Salmonella é extraído, cortado em fragmentos com enzimas de restrição, separados por tamanho em gel de agarose e hibridizados em uma membrana contendo fragmentos de DNA marcados, denominados sondas.
O padrão de fragmentos recuperado geralmente consiste em 5 a 10 bandas de DNA hibridizado e o mesmo é então comparado com um banco de dados contendo os padrões de bandas para sorotipos conhecidos.
Contudo, algumas limitações do método são conhecidas, como a dificuldade para discriminação de sorotipos proximamente relacionados, uma vez que poucas regiões do genoma são analisadas (5 a 10 sítios de genes que codificam RNAs ribossomais). Outro fator limitante é o banco de dados do método, que possui os padrões de fragmentos caracterizados para aproximadamente 200 sorotipos de Salmonella dos 2.600 que são conhecidos.
-
Tipagem de sequências multilocus (MLST – Multilocus Sequence Typing)
Método molecular baseado na determinação de sequências nucleotídicas de genes marcadores. O MLST é um método bastante reprodutível com resultados equivalentes entre os diferentes laboratórios que executam esse método.
Além disso, diversos bancos de dados de acesso público contêm uma grande quantidade de dados de perfis alélicos de MLST.
Contudo, o MLST também possui limitações para a discriminação acurada dos resultados uma vez que, analisa em geral, no máximo 07 regiões gênicas. Em sorovariedades com relações filogenéticas próximas (alto grau de parentesco) torna-se difícil a diferenciação das mesmas.
Quando se realiza uma análise filogenética para caracterização dos isolados, é comum observar sua separação em grupos que não refletem a identidade dos sorotipos. Isto ocorre uma vez que, evolutivamente os genes sequenciados para MLST não se correlacionam necessariamente com a classificação de sorotipos amplamente utilizada (White-Kauffmann).
-
Eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis)
Método molecular baseado em fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição e seus padrões de bandas em gel (DNA fingerprinting). Em geral o resultado de um PFGE gera entre 5 a 20 bandas no gel, dependendo do sorotipo de Salmonella e enzima de restrição utilizada.
Isto significa que, em geral, no máximo 20 regiões genômicas são analisadas no PFGE, considerando apenas os sítios clivados pela enzima de restrição utilizada. Mutações ou variações nucleotídicas ocorrendo em outras regiões do genoma não podem ser observadas ou avaliadas pelo método PFGE.
Dada a análise deste número de regiões genômicas, o PFGE tem um poder de discriminação entre isolados maior do que a Ribotipagem ou o MLST. Contudo, menor que o sequenciamento de genoma completo (WGS).
Ainda, o PFGE é um método que consome bastante tempo e é de difícil padronização, apresentando variações técnicas entre as análises e os padrões de bandas obtidos entre diferentes laboratórios que executam o ensaio. Variações biológicas nos sítios de restrição dificultam a identificação do sorotipo o que resulta em altas taxas de falsos negativos, ou falsos positivos e diminuem a acurácia do método.
Atualmente, o método PFGE – considerado como “padrão ouro” – para sorotipagem está sendo gradativamente substituído pelo método de sequenciamento de genoma completo (WGS) que proporciona uma melhor resolução e acurácia sobre os resultados, como referenciado no PulseNet (https://www.cdc.gov/pulsenet/next-generation.html), um dos maiores bancos de referência de PFGE disponíveis.
-
Sequenciamento WGS
O sequenciamento WGS proporciona não só uma identificação rápida e acurada dos sorotipos de Salmonella, mas também possibilita a comparação direta entre os genomas sequenciados e/ou genomas de referência.
Esta comparação entre genomas, denominada análise de clonalidade pela Neoprospecta, revela quão similares são os genótipos (DNA) dos microrganismos de interesse, avaliando o número de variações nucleotídicas únicas (SNVs) entre os genomas comparados. Os genomas de Salmonella enterica têm um tamanho médio aproximado de 4.8Mb (4.800.000 bases nucleotídicas).
Utilizando a abordagem WGS (Whole Genome Sequencing) é possível identificar e caracterizar todos esses nucleotídeos que compõe o DNA de Salmonella. Uma vez que a sequência genômica do isolado de Salmonella estiver disponível, todos os resultados que seriam obtidos com as demais metodologias (MLST, Ribotipagem, PFGE) podem ser estudados através da análise direta do genoma.
Desta forma o WGS é o método mais abrangente, chegando em nível máximo de resolução para avaliação e comparação de isolados de Salmonella.