O ensaio FGene SLM foi desenvolvido pela Neoprospecta para a detecção rápida de Salmonella spp. por PCR em tempo real.
A Neoprospecta investigou o limite de detecção (LOD) do ensaio FGene SLM partindo de enriquecimento bacteriano e suspensão celular de isolado bacteriano, a fim de estabelecer qual a mínima quantidade de Salmonella spp. que o método é capaz de detectar.
O estudo foi desenvolvido utilizando um microrganismo de referência certificado – Salmonella enterica (ATCC 14028).
Cultivos enriquecidos partindo de diferentes concentrações, serviram para determinar o limite de detecção em UFC/ml, e suspensões celulares puras, com diferentes concentrações, sem enriquecimento prévio, foram utilizadas para estabelecer o limite de detecção em ng/ul de DNA.
Metodologia de detecção de Salmonella spp.
O ensaio FGene SLM visa determinar a presença ou ausência de Salmonella spp. em amostras de alimentos ou em suspensões celulares de microrganismos.
Para determinados tipos de amostra (ex.: alimentos) o processo possui uma etapa adicional de enriquecimento em meio não seletivo, o que potencializa a detecção das espécies de Salmonella, quando presentes em baixas concentrações.
Independentemente da amostra investigada, o ensaio FGene SLM diferencia-se fundamentalmente de outras metodologias por não basear-se em aspectos morfológicos e bioquímicos, e sim, em uma metodologia molecular (PCR em tempo real) que identifica sequências específicas do DNA de Salmonella enterica e Salmonella bongori.
Assim, de uma maneira rápida, simples e objetiva, é possível determinar a presença ou ausência de Salmonella spp em uma dada amostra.
Os valores encontrados nos estudos do limite de detecção podem ser apresentados tanto em valores de UFC/ml, para as amostras que passaram por um processo de enriquecimento (como os alimentos), quanto em valores de ng/ul de DNA, para as amostras que não preveem uma etapa de enriquecimento, como as suspensões celulares de microrganismos.
Limites de detecção
Para definir as propriedades de um método, é imprescindível conhecer o limite de detecção, ou a quantidade mínima detectável do microrganismo-alvo.
O limite de detecção do ensaio FGene SLM foi avaliado, utilizando como inóculo-alvo, o microrganismo de referência certificado S. enterica (ATCC 14028), em diferentes concentrações e em experimentos com e sem enriquecimento do microrganismo.
Para a análise FGene SLM com enriquecimento as alíquotas das diluições foram incubadas por 22h a 35ºC.
Enquanto que, para as alíquotas das diluições do FGene sem enriquecimento, as bactérias foram concentradas por centrifugação e diretamente ressuspendidas em solução NeoSampleX, constituindo uma suspensão celular de microrganismos.
As amostras de ambas as abordagens seguiram para a extração de DNA utilizando beads magnéticas (metodologia Neoprospecta, Brasil).
A concentração do DNA das amostras de suspensão de microrganismos (sem cultivo) foi determinado utilizando QubitTM PicogreenTM (Invitrogen, USA).
A menor quantidade que o ensaio FGene SLM detectou de S. enterica com 100% de concordância entre as réplicas na PCR em tempo real foi 0,1 UFC/ml e 0,0000309 ng/ul de DNA genômico total.
Os valores encontrados demonstram que o método de detecção de Salmonella spp., desenvolvido pela Neoprospecta, é capaz de identificar este microrganismo de interesse em baixas concentrações de UFC/ml ou ng/ul.
Dessa maneira, o método é capaz de identificar baixos níveis de contaminação de Salmonella spp. tanto em amostras que passam por processo de enriquecimento dos microrganismos (ex. amostras de alimento), quanto aquelas que são analisadas sem a etapa de enriquecimento, a exemplo de suspensões celulares de microrganismos em tampão.