Os alérgenos são proteínas ou glicoproteínas que podem ser encontrados em alimentos e medicamentos. Técnicas de biologia molecular permitem a detecção e quantificação cada vez mais rápida e precisa dos alérgenos.
O que são alérgenos?
Os alérgenos são substâncias compostas por proteínas que induzem uma reação de hipersensibilidade imediata no indivíduo após o contato dérmico, por inalação ou ingestão. Os alérgenos mais conhecidos são pólens, esporos de fungos, ácaros presentes na poeira, mas também podem estar presentes em venenos de insetos, medicamentos ou alimentos (1,2).
Atualmente, é crescente o número de indivíduos alérgicos, impulsionando a demanda por produtos livres de alérgenos (3) e por isso, as industrias alimentícias além devem se preocupar com a detecção e também evitar a contaminação cruzada.
Como detectar um alérgeno?
Considerando que grande parte dos alérgenos são proteínas ou glicoproteínas, a detecção é realizada principalmente por meio de técnicas moleculares, baseados em componentes como proteínas e DNA (1), como veremos a seguir.
Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction)
Figura 1: Reagentes e Etapas da PCR convencional. Disponível em: https://www.bosterbio.com/protocol-and-troubleshooting/molecular-biology-principle-pcr
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional é a técnica que amplifica (copia) um fragmento do DNA (que codifica a proteína alergênica) de maneira exponencial e específica.
A cada ciclo da PCR, as variações de temperatura e reagentes utilizados permitem a desnaturação, o anelamento e a extensão do fragmento de DNA de interesse.
Logo após esse processo, as amostras são submetidas a eletroforese (técnica que separa os fragmentos de DNA de acordo com o peso molecular) permitindo a identificação da presença ou não do DNA que codifica a proteína alergênica, ou seja, trata-se de um método qualitativo (3,5).
Figura 2: RT-PCR. Disponível em: https://startbioscience.com.br/abm-kit-de-deteccao-rapida-covid-19-por-rt-qpcr/
A PCR em tempo real (qPCR ou qRT-PCR) é uma variação da técnica de PCR, realizada a partir da conversão da molécula de RNA em DNA, e na presença de um reagente fluorescente detectado pelo equipamento em tempo real. Isso permite a visualização da amplificação do DNA à medida que a reação ocorre e dispensa a etapa de eletroforese. Dessa forma, a qRT-PCR possibilita a quantificação do DNA que codifica a proteína alergênica, sendo um método qualitativo e quantitativo (3,5) (Figura 2).
A técnica de PCR é rápida, com alta sensibilidade e especificidade. É uma boa alternativa para detecção de alérgenos em amostras com proteínas desnaturadas, como os alimentos processados. Entretanto, possui custo elevado e pode ser questionada uma vez que a expressão do DNA nem sempre é proporcional a expressão da proteína alergênica (4,5).
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Método imunoenzimático que permite detectar e quantificar substâncias solúveis como peptídeos, proteínas e anticorpos. A técnica possui diferentes variações, mas todas são baseadas na interação antígeno-anticorpo, e a maioria é comercializada na forma de kits (6).
Basicamente, a análise ocorre em placas revestidas com anticorpos específicos para o antígeno de interesse. Após a adição da amostra, é adicionado também um anticorpo primário conjugado com enzima repórter (ou um outro marcador) formando um complexo cujo sinal pode ser detectado por equipamentos como espectrofotômetro ou fluorômetro. Quanto maior o sinal emitido, maior a quantidade do antígeno de interesse (proteínas alergênicas) na amostra (6,7). Veja o vídeo para entender melhor
O ELISA é um método rápido, simples, de alta especificidade e sensibilidade, e que permite a obtenção de resultados quantitativos e a validação de outros métodos menos sensíveis. Suas desvantagens são a alta suscetibilidade à reatividade cruzada com proteínas que não são alvo da análise (mas que possuem estrutura semelhante a proteína de interesse); a detecção de apenas uma proteína alergênica por ensaio; e a limitação na análise de amostras cujas estruturas proteicas tenham sido alteradas por processamento ou desnaturação (3,5).
Espectrometria de massa
Considerado o melhor método de detecção de proteínas alergênicas. Associada a cromatografia líquida ou gasosa, promove o bombardeamento das moléculas por um feixe de elétrons com alta energia, separando os íons de acordo com sua massa e carga. Em seguida, o espectro obtido é comparado as sequências proteicas de uma base de dados, permitindo a identificação das proteínas alergênicas (4,5).
A técnica possui alta sensibilidade, precisão e pode detectar diferentes alergênicos em uma única análise. Além disso, como a identificação da proteína é baseada na sequência de aminoácidos e não na estrutura proteica, a espectrometria pode ser usada para amostras processadas ou hidrolisadas (3,4,5).
Contudo, a espectrometria é um método complexo e de alto custo, e por isso é mais utilizado para confirmar os resultados obtidos em outros métodos de detecção. Outra limitação da técnica é a impossibilidade de identificar aminoácidos com massas idênticas (4,5).
As técnicas atuais permitem a detecção e quantificação cada vez mais rápida e precisa dos alérgenos. Mas certamente os avanços biotecnológicos, principalmente na área de biologia molecular, serão úteis para reduzir os custos e aprimorar a especificidade dessas metodologias.
A Neoprospecta possui ferramentas exclusivas que utilizam análises moleculares para auxiliar a geração de conhecimento e inteligência para a tomada de decisões aumentando a qualidade e segurança dos alimentos.
Por isso, contate-nos e esclareça suas dúvidas!
Referências bibliográficas:
1- Lei, DK & Grammer, LC. An overview of allergens. Allergy Asthma Proc. Nov 1;40(6):362-365, 2019. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31690370/
2- Perez, RG. Nuevas Técnicas de diagnóstico molecular en alergologia. Canarias Pediátrica; Vol 42, No 3, 2018. Disponível em: https://scptfe.com/wp-content/uploads/2020/10/vol-42-n3-Nuevas-Tecnicas-de-diagnostico-molecular-en-alergologia.pdf
3- Daly, M. et al. Assessing Almond and Peanut Allergens Using Commercially Available Immunoanalytical Kits and LC-MS/MS: A Case Study. J AOAC Int. Jan 1;101(1):96-101, 2018. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29202912/
4- Van Gasse, AL, et al. Molecular allergy diagnosis: Status anno 2015. Clin Chim Acta. Apr 15;444:54-61, 2015. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25681645/
5- Benites, AJ. Implementação e validação do método de detecção de alérgenos em alimentos por PCR em Tempo Real no Laboratório SGS. Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, 2016. Disponível em: https://run.unl.pt/handle/10362/17295
6- Horlock, C. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). British Society for Immunology. Disponível em: https://www.immunology.org/public-information/bitesized-immunology/experimental-techniques/enzyme-linked-immunosorbent-assay
7- Thermo Fisher Scientific. Overview of ELISA. Disponível em: https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-elisa.html
Autora
Bruna Pereira Lopes
Biotecnologista, Doutora em Ciências e Pós- doutorado em Fisiopatologia Clínica e Experimental. Pesquisadora e docente nas áreas de fisiologia, biologia molecular e metabolismo. Experiência em produção e revisão de conteúdo e divulgação científica.