Métodos para a caracterização de sorotipos de Salmonella

Em textos anteriores (clique aqui para ler o texto) tratamos dos sorotipos de Salmonella, quais os riscos que a infecção por essa bactéria traz para a saúde humana e qual a importância de tomar os devidos cuidados no manuseio de alimentos para evitarmos essas contaminações.
Essa bactéria apresenta uma epidemiologia complexa e de difícil controle, necessitando de melhores métodos de tipificação para que possamos caracterizar e discriminar as cepas e, assim, termos uma melhor compreensão sobre a transmissão, patogênese e filogenia da Salmonella.
Muitos métodos capazes de diferenciar isolados de Salmonella já foram desenvolvidos e devem ser constantemente empregados para garantir a vigilância epidemiológica, considerando o aumento da diversidade de sorovares.

Métodos para a tipificação de Salmonella

Os métodos de tipificação auxiliam no monitoramento epidemiológico de cepas, permitindo a investigação de origens de surtos alimentares, além da detecção de focos de contaminação em ambientes de processamento de produtos alimentares.
Os métodos de tipificação são qualquer método que possa diferenciar os microrganismos usando como base a capacidade de comparar isolados e agrupar cepas que demonstrem resultados idênticos. Eles podem ser baseados tanto no fenótipo – caracterização dos produtos da expressão gênica – quanto no genótipo – análise da estrutura genética.

Alguns critérios devem ser levados em conta no momento de escolher o método para tipificação. Deve-se avaliar principalmente:

A capacidade do método em tipificar as linhagens analisadas. Um método que diferencia as linhagens patogênicas das não patogênicas, por exemplo, pode auxiliar na tomada de decisão em casos de surtos e contaminações com salmonella.

A reprodutibilidade do ensaio, mostrando que os testes de um determinado isolado, em ocasiões diferentes, gera resultados iguais. Para isso é necessário uma estrita padronização das técnicas. Esse parâmetro é importante para garantir a confiabilidade dos testes.⦁ A reprodutibilidade do ensaio, mostrando que os testes de um determinado isolado, em ocasiões diferentes, gera resultados iguais. Para isso é necessário uma estrita padronização das técnicas. Esse parâmetro é importante para garantir a confiabilidade dos testes.

O poder de discriminação, que é uma competência de cada técnica, mostrando a diferenciação dos isolados não relacionados e ao mesmo tempo sendo capaz de apresentar a relação de todos os organismos isolados de indivíduos contaminados por meio da mesma fonte.⦁ O poder de discriminação, que é uma competência de cada técnica, mostrando a diferenciação dos isolados não relacionados e ao mesmo tempo sendo capaz de apresentar a relação de todos os organismos isolados de indivíduos contaminados por meio da mesma fonte.

Métodos fenotípicos

Majoritariamente, os métodos fenotípicos apresentam baixa reprodutibilidade em comparação aos métodos genotípicos. As diferenças nesse critério acontecem devido a grande capacidade bacteriana de alterar a manifestação dos produtos celulares de forma imprevisível e ao fato desses métodos usarem como base de avaliação propriedades verdadeiramente expressas pelas bactéria. Por isso, muitas dessas técnicas são usadas como inicialmente e associadas a técnicas mais avançadas.

⦁ Sorotipificação

A técnica de sorotipificação é baseada nas diferentes combinações dos antígenos capsulares, somáticos e flagelares responsáveis pela classificação de Salmonella em sorotipos. Para avaliar quais os antígenos, são utilizados anticorpos específicos para as estruturas antigênicas presentes na superfície celular da bactéria.

Essa técnica é muito importante nas indústrias como estudo preliminar para analisar a correlação entre os isolados ao longo da cadeia produtiva, fornecendo indícios de fontes de contaminação. Portanto, esse método tradicional fornece informações essenciais, com certas limitações, sendo necessário que outras técnicas de tipificação sejam aplicadas em conjunto para melhorar a caracterização das cepas analisadas.

2. Perfil de suscetibilidade a antimicrobianos

O perfil de suscetibilidade antimicrobiano é uma técnica baseada na resistência ou suscetibilidade da bactéria a antimicrobianos, no caso específico aos antibióticos. Tem como princípio a utilização de discos de antimicrobianos em uma placa previamente inoculada e incubada com as bactérias. Avalia-se se houve ou não crescimento da bactéria ao redor de cada disco e se classifica então as cepas como sendo ou não suscetíveis aos antibióticos testados.

Essa técnica, assim como todas as fenotípicas é variável, pois o genoma bacteriano é extremamente dinâmico e está sujeita a diferentes pressões seletivas. A maioria dos fatores que determinam a resistência são carreados por elementos móveis como os plasmídeos, transposons e integrons e na ausência de pressão seletiva, estes elementos podem ser perdidos. Por isso, linhagens diferentes podem desenvolver padrões de resistência semelhantes, ao mesmo tempo que isolados pertencentes à mesma linhagem podem diferir no perfil de sensibilidade. A avaliação desse perfil é muito utilizado como marcador epidemiológico, sendo uma ferramenta útil na identificação da emergência de linhagens resistentes, ainda que não permita identificar a sorovaridade.

Métodos genotípicos

Os métodos genotípicos ou moleculares, por analisarem a genética microbiana e não as características expressas no momento e que podem variar, minimizam as desvantagens dos métodos fenotípicos em relação a reprodutibilidade, poder discriminatório e tipicidade das técnicas. Esse conjunto também proporciona o aumento da colaboração e assim o desenvolvimento de bases de dados conjuntas, para melhorar e aumentar o conhecimento sobre as diferentes cepas de Salmonella.
Entretanto, nenhuma abordagem molecular combina reprodutibilidade e poder discriminatório com rapidez e simplicidade, devendo levar em conta o tempo, o custo e as dificuldades de execução para escolher o melhor ou a associação dos melhores métodos para o que está se analisando e qual o objetivo que se quer obter com aquela análise.

1. Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD)

Essa técnica é uma variação da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Ao contrário da PCR, nela não precisa-se de conhecimento prévio sobre a sequência que se deseja amplificar, criando-se primers que se anelam em diversas regiões e amplificam essas diversas partes. Cada espécie de Salmonella apresenta um perfil de amplificação diferente, sendo que devido a esses perfis podemos distinguir cada uma das espécies e classificá-las.
A reprodutibilidade da técnica pode variar de acordo com temperatura de anelamento dos primers, concentração e qualidade do DNA molde a ser amplificado, qualidade da  enzima polimerase utilizada, o termociclador e principalmente, qual a sequência e tamanho de primers randômicos que estão sendo utilizados.

2. Eletroforese em campo pulsado (PFGE)

Essa técnica era considerada a melhor técnica desenvolvida até a popularização do sequenciamento do genoma. Ela se baseia em um sequenciamento realizado por enzimas de restrição de corte raro, gerando fragmentos de alto peso molecular que não são separados pela eletroforese convencional. Por isso é aplicada um campo pulsado, que permite a separação desses fragmentos. A interpretação do resultado é feita de modo comparativo, analisando os perfis apresentados e entendendo que que eventos genéticos ocorridos ao acaso, podem alterar estes perfis.
A principal limitação da técnica é o tempo necessário para a execução de todo o protocolo, principalmente devido a necessidade do campo pulsado que demanda mais tempo que a análise de eletroforese convencional. PFGE apresenta alto poder discriminatório e estabilidade dos perfis gerados, adequada para a caracterização de linhagens, rastreamento de surtos alimentares e criação de bases de dados, que devem ser usadas para melhorar a interpretação e evitar conclusões errôneas sobre as cepas analisadas.

3. Sequenciamento de DNA

O sequenciamento vem ganhando mais espaço no mercado a cada ano. Sua popularização, devido à queda dos preços, permite que a técnica esteja mais difundida e, com isso, mais pessoas podem atestar as vantagens do sequenciamento, seja ele do genoma completo, do exoma ou até mesmo de plasmídeos. Na caracterização da Salmonella, o sequenciamento completo do genoma bacteriano consegue distinguir com precisão quais os sorotipos presentes em uma amostra.

Saiba mais sobre métodos de tipificando nesse e-book elaborado pela Neoprospecta. (para acessar o e-book clique aqui).

Referências

KOTTWITZ, Luciana Bill Mikito; OLIVEIRA, Tereza Cristina R. M.  Métodos de caracterização fenotípica e genotípica de Salmonella Enteritidis e a utilidade da técnica PFGE em estudos epidemiológicos . Biosaúde, Londrina, v. 13, n. 1/2, p.38-59, 2011.

MOREIRA, Natália Menezes. MÉTODOS DE TIPIFICAÇÃO DE Salmonella sp. 2012- Curso de Pós-graduação em Ciência Animal, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2012.

LIM, H.; LEE, K. H.; HONG, C. H.; BAHK, G. J.; CHOI, W. S. Comparison of four molecular typing methods for the differentiation of Salmonella sp. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, p. 411 – 418, 2005.

OLSEN, J. E.; BROWN, D. J.; SKOV, M. N.; CHRISTENSEN, J. P. Bacterial typing methods suitable for epidemiological analysis applications in investigations of salmonellosis among livestock. Veterinary Quarterly, Holanda, v. 15, n. 4, p. 125-135, 1993.

TENOVER, F. C.; ARBEIT, R. D.; GOERING, R. V. How to select and interpret molecular strain typing methods for epidemiological studies of bacterial infections: a review for healthcare epidemiologists. Infection Control and Hospital Epidemiology, Thorofare, v. 18, p. 426-439, 1997.

GUIMARÃES, A.R. Resistência aos antimicrobianos, diversidade e relação epidemiológica de bactérias do gênero Salmonella spp. isoladas na granja de terminação e abate de suínos. 2010. 56 f. Dissertação (Mestrado em medicina veterinária) – Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia.

WEIDE-BOTJES, M.; KOBE, B.; SCHWARZ, S. Inter- and intra-phage type differentiation of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis isolates using molecular typing methods. Zentralblatt für Bakteriologie, Stuttgart, v.288, p.181- 193, 1998.

OLIVE, D. M.; BEAN, P. Principles and applications of methods for DNA based typing of microbial organisms. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v. 37, p. 1661–1669, 1999.

FOLEY, S. L.; LYNNE, A. M.; NAYAK, R. Molecular typing methodologies for microbial source tracking and epidemiological investigations of Gram-negative bacterial foodborne pathogens. Infections, Genetic and Evolution, Amsterdam, v. 9, p. 430–440, 2009.

CASTIGLIONI, L.; BICUDO, H. E. M. C. A Técnica de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e suas aplicações para estudos em genética molecular. Revista UNORP, São José do Rio Preto, v. 3, n. 2, p. 63-77, 2003.